对丹麦战争结束后不久,俾斯麦便着手准备向最主要的敌手奥地利开战。他除得到俄、法守中立的保证外,还与1861年刚建立的意大利王国订立了同盟条约,使奥地利被孤立。这样,普鲁士于1866年6月出兵占领荷尔施泰因,挑起了对奥战争。开战后普军进展顺利,于7月3日在捷克境内的萨多瓦村大败奥军主力,14日逼近维也纳。奥军无力再战,遂请法国出面调停。为避免法奥结盟,俾斯麦没有向维也纳进军并同意议和。据8月签订的布拉格和约,奥地利退出德意志邦联并宣布解散邦联;承认普鲁士有权在美因河以北建立北德意志联邦;承认普鲁士占有荷尔施泰因和吞并在战争中协助奥地利的汉诺威、黑森、拿骚和法兰克福自由市;奥地利将威尼斯归还意大利;普奥两国均不过问南德4邦的领土主权问题。
普奥战争是统一过程中的关键性一战。此战消除了普鲁士统一全德的最大障碍,而且使普鲁士领土连成一片,面积增加到34万多平方公里,占全德面积的2/5,人口增至2400万,占全德人口2/3。1867年由普鲁士控制的北德意志联邦成立,包括21个邦国和3个自由市。它有统一的议会,军、政、外交大权掌握在普鲁士手中,联邦主席是威廉一世,总理由俾斯麦兼任。北德意志联邦明显带有统一国家的性质,它的成立是统一过程中的决定性步骤。多民族的奥地利帝国被排除出德意志之外,使德意志具备了建立统一民族国家的条件,日耳曼民族主义一时成为鼓舞人们热情的精神力量。
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